第5章 分子发光分析法
Molecular Luminescence Analysis , MLA
物质的分子吸收一定的能量后，其电子从基态跃迁到激发态，如果在返回基态的过程中伴随有光辐射，这种现象称为分子发光（molecular luminescence），以此建立起来的分析方法，称为分子发光分析法。
物质因吸收光能激发而发光，称为光致发光（根据发光机理和过程的不同又可分为荧光和磷光）；因吸收电能激发而发光，称为电致发光；因吸收化学反应或生物体释放的能量激发而发光，称为化学发光或生物发光。根据分子受激发光的类型、机理和性质的不同，分子发光分析法通常分为荧光分析法，磷光分析法和化学发光分析法。
目前，分子发光分析法在生物化学，分子生物学，免疫学，环境科学以及农牧产品分析，卫生检验、工农业生产和科学研究等领域得到了广泛的应用。
荧光和磷光的产生涉及光子的吸收和再发射两个过程。
1. 激发过程
物质受光照射时，光子的能量在一定条件下被物质的基态分子所吸收，分子中的价电子发生能级跃迁而处于电子激发态，在光致激发和去激发光过程中，分子中的价电子可以处于不同的自旋状态，通常用电子自旋状态的多重性来描述。一个所有电子自旋都配对的分子的电子态，称为单重态，用“S”表示；分子中的电子对的电子自旋平行的电子态，称为三重态，用“T”表示。
电子自旋状态的多重态用2S+1表示，S是分子中电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1。如果分子中全部轨道里的电子都是自旋配对时，即S=0，多重态2S+1=1，该分子体系便处于单重态。大多数有机物分子的基态是处于单重态的，该状态用“S0”表示。倘若分子吸收能量后，电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，这时分子处于激发单重态；如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，这时分子便具有两个自旋平行（不配对）的电子，即S=1，多重态2S+1=3，该分子体系便处于激态三重态。符号S0、S1、S2分别表示基态单重态，第一和第二电子激发单重态；T1和T2则分别表示第一和第二电子激发三重态。如图5.1所示。
（a）基态单重态 （b）激发单重态 （c）激发三重态
图5.1 单重态及三重态激发示意图
图5.2 荧光和磷光能级图
S0、S1、S2分别表示分子的基态、第一和第二激发单重态；
T1，T2分别表示第一和第二激发三重态。
2. 发射过程
处于激发态的分子是不稳定的，通常以辐射跃迁或无辐射跃迁方式返回到基态，这就是激发态分子的失活（deactivation）。辐射跃迁的去活化过程，发生光子的发射，即产生荧光和磷光；无辐射跃迁的去活化过程则是以热的形式失去其多余的能量，它包括振动弛豫、内转换、系间跨越及外转换等过程。如图5.2所示。
(1)振动弛豫（Vibration
Relaxation，VR） 由于分子间的碰撞，振动激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转移至较低振动能级的无辐射跃迁过程。发生振动弛豫的时间约为10-12 s数量级。
(2)内转换（Internal
Conversion，IC） 指在相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级转移至低能级的无辐射跃迁过程。当两个电子能级非常靠近以致其能级有重叠时，内转换很容易发生。两个激发单重态或两个激发三重态之间能量差较小，并且它们的振动能级有重叠，显然这两种能态之间易发生内转换。
(3)荧光发射 激发态分子经过振动驰豫降到激发单重态的最低振动能级后，如果是以发射光量子跃迁到基态的各个不同振动能级，又经振动驰豫回到最低基态时就发射荧光。
(4)系间跨越（Intersystem
Crossing，ISC） 是指不同多重态间的无辐射跃迁，同时伴随着受激电子自旋状念的改变，如S1→T1。在含有重原子（如溴或碘）的分子中，系间跨越最常见。这是因为在原子序数较高的原子中，电子的自旋和轨道运动间的相互作用变大，原子核附近产生了强的磁场，有利于电子自旋的改变。所以含重原子的化合物的荧光很弱或不能发生荧光。
(5)外转换（External
Conversion，EC） 是指激发分子通过与溶剂或其他溶质分子间的相互作用使能量转换，而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程。这一现象又称为“熄灭”或“猝灭”。
(6)磷光发射 第一激发单重态的分子，有可能通过系间跨越到达第一电子激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发三重态的最低振动能级，再以无辐射形式失去能量跃迁回基态而发射磷光。
3．分子荧光和磷光的类型
（1）分子荧光 处于S1或T1态的分子返回S0态时伴随发光现象的过程称为辐射去激，分子从S1态的最低振动能级跃迁至S0态各个振动能级所产生的辐射光称为荧光，它是相同多重态间的允许跃迁，其几率大，辐射过程快，一般在10－9～10－6s内完成，因此也叫快速荧光或瞬时荧光。
由于荧光物质分子吸收的光能经过无辐射去激的消耗后降至S1态的最低振动能级，因而所发射的荧光的波长比激发光长，能量比激发光小，这种现象称为斯托克斯（stokes）位移。斯托克斯位移越大，激发光对荧光测定的干扰越小，当它们相差大于20
nm以上时，激发光的干扰很小，可以进行荧光测定。
（2）分子磷光 当受激分子降至S1的最低振动能级后，经系间窜跃至T1态，并经T1态的最低振动能级回到S0态的各振动能级所辐射的光称为磷光。磷光在发射过程中分子不但要改变电子的自旋，而且可以在亚稳的T1态停留较长的时间，分子相互碰撞的无辐射能量损耗大。所以，磷光的波长比荧光更长些，寿命约为10－4～10 s，因此，在光照停止后，仍可持续一段时间。
（3）延迟荧光 分子跃迁至T1态后，因相互碰撞或通过激活作用又回到S1态，经振动驰豫（VR）到达S1态的最低振动能级再发射荧光，这种荧光称为延迟荧光。
不论何种类型的荧光，都是从S1态的最低振动能级跃迁至S0态的各振动能级产生的。所以，同一物质在相同条件下观察到的各种荧光其波长完全相同，只是发光途径和寿命不同。延迟荧光在激发光源熄灭后，可拖后一段时间，但和磷光又有本质区别，同一物质的磷光波长总比发射荧光的波长长。
任何荧光或磷光化合物都具有两种特征的光谱：激发光谱和发射光谱。
1.激发光谱（荧光激发光谱）
激发光谱，就是通过测量荧光体的发光强度随激发光波长的变化而获得的光谱，它反映了不同波长激发光引起荧光的相对效率。激发光谱的具体测绘办法，是通过扫描激发单色器以使不同波长的入射光激发荧光体，然后让所产生的荧光通过固定波长的发射单色器而照射到检测器上，由检测器检测相应的荧光强度，最后通过记录仪记录荧光强对激发光波长的关系曲线，即为激发光谱。
从理论上说，同一物质的最大激发波长应与最大吸收波长一致，这是因为物质吸收具有特定能量的光而激发，吸收强度高的波长正是激发作用强的波长。因此，荧光的强弱与吸收光的强弱相对应，激发光谱与吸收光谱的形状应相同，但由于荧光测量仪器的特性，例如光源的能量分布、单色器的透射和检测器的响应等特性都随波长而改变，使实际测量的荧光激发光谱与吸收光谱不完全一致。只有对上述仪器因素进行校正之后而获得的激发光谱，即通常所说的“校正的激发光谱”（或“真实的激发光谱”）才与吸收光谱非常近似。
2. 发射光谱（荧光或磷光光谱）
如使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所产生的荧光通过发射单色器后照射于检测器上，扫描发射单色器并检测各种波长下相应的荧光强度，然后通过记录仪记录荧光强度对发射波长的关系曲线，所得到的谱图称为荧光发射光谱（简称荧光光谱）。荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。荧光光谱可供鉴别荧光物质，并作为在荧光测定时选择适当的测定波长或滤光片的根据。
和激发光谱的情况类似，在一般的荧光测定仪器上所测绘的荧光光谱，属“表现”的荧光光谱，只有对光源、单色器和检测器等元件的光谱特性加以校正以后，才能获得“校正”（或“真实”）的荧光光谱。
溶液的荧光光谱通常有以下几个特征：
(1) Stokes位移 在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光的波长总是大于激发光的波长，即λem＞λex。这主要是由于发射荧光之前的振动驰豫和内转换过程损失了一定的能量，这是产生Stokes位移的主要原因。
(2) 荧光发射光谱的形状与激发波长无关 由于荧光发射发生于第一电子激发态的最低振动能级，而与荧光体被激发至哪一个电子态无关，所以荧光光谱的形状通常与激发波长无关。
(3) 与激发光谱大致成镜像对称关系 一般情况下，基态和第一电子激发单重态中振动能级的分布情况是相似的，所以荧光光谱同激发光谱的第一谱带大致成镜像对称。如图5.3所示。
图5.3 荧光光谱与吸收光谱关系图
物质分子吸收辐射后，能否发生荧光取决于分子的结构。荧光强度的大小不但与物质的分子结构有关，也与环境因素有关。
1. 荧光量子产率又称荧光效率，通常用下式表示：
它表示物质发射荧光的能力，Φf越大，发射的荧光越强。由前面已经提到的荧光产生的过程中可以明显地看出，物质分子的荧光产率必然由激发态分子之活化过程的各个相对速率决定。若用数学式来表达这些关系，得到
（5.1）
式（5.1）中，kf为荧光发射的速率常数，∑ ki为其他无辐射跃迁速率常数的总和。显然，凡是能使kf升高而其他ki值降低的因素都可使荧光增强；反之，荧光就减弱。kf的大小主要取
决于化学结构；其他ki值则强烈地受环境的影响，也轻微地受化学结构的影响。磷光的量子产率与此类似。
2. 荧光与分子结构的关系
(1)电子跃迁类型 含有氮、氧、硫杂原子的有机物，如喹啉和芳酮类物质都含有未键合的n电子，电子跃迁多为n—π*型，系间跨越强烈，荧光很弱或不发荧光，易与溶剂生成氢键或质子化，从而强烈地影响它们的发光特征收。
不含氮、氧、硫杂原子的有机荧光体多发生π→π*类型的跃迁，这是电子自旋允许的跃迁，摩尔吸收系数大（约为104），荧光辐射强。
(2)共轭效应
增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大，并使荧光波长向长波方向移动。共轭效应使荧光增强的原因，主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，π电子更容易被激发，产生更多的激发态分子，使荧光增强。
(3)刚性结构和共平面效应 一般说来，荧光物质的刚性和共平面性增强，可使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减小，即使外转移能量损失减小，从而有利于荧光的发射。例如：芴与联二苯的荧光效率分别约为1.0和0.2。这主要是由于亚甲基使芴的刚性和共平面性增大的缘故。
芴
联二苯
如果分子内取代基之间形成氢键，加强了分子的刚性结构，其荧光强度将增强。例如：水杨酸的水溶液，由于分子内氢键的生成，其荧光强度比对（或间）羟基苯甲酸大。
某些荧光体的立体异构现象对它的荧光强度也有显著影响，例如：1.2一二苯乙烯
其分子结构为反式者，分子空间处于同一平面，顺式者则不处于同一平面，因而反式者呈强荧光，顺式者不发荧光。
(4)取代基效应
芳烃和杂环化合物的荧光光谱和荧光强度常随取代基而改变。表5.1列出了部分基团对苯的荧光效率和荧光波长的影响。一般说来，给电子取代基如-OH，-NH2，-OR，-NR2等能增强荧光；这是由于产生了p-π共轭作用，增强了π电子的共轭程度，导致荧光增强，荧光波长红移。而吸电子取代基如-NO2，-COOH，-C＝O，卤素离子等使荧光减弱。这类取代基也都含有π电子，然而其π电子的电子云不与芳环上π电子共平面，不能扩大π电子共轭程度，反而使S1→T1系间跨越增强，导致荧光减弱，磷光增强。例如苯胺和苯酚的荧光较苯强，而硝基苯则为非荧光物质。
卤素取代基随卤素相对原子质量的增加，其荧光效率下降，磷光增强。这是由于在卤素重原子中能级交叉现象比较严重，使分子中电子自旋轨道耦合作用加强，使S1→T1系间跨越明显增强的缘故，称为重原子效应。
表5.1 苯及其衍生物的荧光（乙醇溶液）
|
化合物 |
分子式 |
荧光波长/nm |
相对荧光强度 |
|
苯 甲苯 丙苯 氟苯 氯苯 溴苯 碘苯 苯酚 酚氧离子 苯甲醚 苯胺 苯胺离子 苯甲酸 苯氰 硝基苯 |
C6H6 C6H5CH3 C6H C6H C6H5Cl C6H5Br C6H5I C6H5OH C6H5O- C6H5OCH3 C6H5NH2 C6H5NH3+ C6H5COOH C6H5CH C6H5NO2 |
270～310 270～320 270～320 270～320 275～345 290～380 － 285～365 310～400 285～345 310～405 － 310～390 280～360 － |
10 17 10 7 7 5 0 18 10 20 20 0 3 20 0 |
3. 环境因素对荧光光谱和荧光强度的影响
(1) 溶剂的影响 同一种荧光体在不同的溶剂中，其荧光光谱的位置和强度都可能会有显著的差别。溶剂对荧光强度的影响比较复杂，一般来说，增大溶剂的极性，将使n→π*跃迁的能量增大，π→π*跃迁的能量降低，从而导致荧光增强。
在含有重原子溶剂如磺乙烷和四溴化碳中，也是由于重原子效应，增加系间窜跃速度，使荧光减弱。
(2) 温度的影响 温度对于溶液的荧光强度有着显著的影响。通常，随着温度的降低，荧光物质溶液的荧光量子产率和荧光强度将增大。如荧光索钠的乙醇溶液，在
(3) pH的影响
假如荧光物质是一种弱酸或弱碱，溶液的pH值改变将对荧光强度产生很大的影响。大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光光谱，对于溶剂的pH和氢键能力是非常敏感的。表5.1中苯酚和苯胺的数据也说明了这种效应。其主要原因是体系的pH值变化影响了荧光基团的电荷状态。当pH改变时，配位比也可能改变，从而影响金属离子-有机配位体荧光配合物的荧光发射。因此，在荧光分析中要注意控制溶液的pH。
(4) 荧光熄灭（fluorescence quenching，或称荧光猝灭） 广义地说，指任何可使某种荧光物质的荧光强度下降的作用或任何可使荧光量子产率降低的作用。狭义地说，荧光熄灭指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象。这些引起荧光强度降低的物质称为熄灭剂。
导致荧光熄灭作用的几种主要类型如下：
①碰撞熄灭 碰撞熄灭是荧光熄灭的主要原因。它是指处于激发单重态的荧光分子M*
与熄灭剂Q发生碰撞后，使激发态分子以无辐射跃迁方式回到基态，因而产生熄灭作用。这一过程可用下列反应式表示：
相对速率
M+f h1→M*（激发）
—
M*→M+f h2
（发生荧光）
[M*]
M*+Q→M+Q+热（熄灭）
[M*][Q]
式中、为相应的反应速率常数。很明显，荧光熄灭程度取决和的相对大小及熄灭剂的浓度。
碰撞熄灭还与溶液的粘度有关。在粘度大的溶剂中，熄灭作用较小。另外，碰撞熄灭随温度升高而增加。
②能量转移 这种熄灭作用产生于熄灭剂与处于激发单重态的荧光分子作用后，发生能量转移，使熄灭剂得到激发，其反应如下：
M*+Q→M+Q*（激发）
如果溶液中熄灭剂浓度足够大，可能引起荧光物质的荧光光谱发生畸变和造成荧光强度测定的误差。
③电荷转移 这种熄灭作用产生于熄灭剂与处于激发态分子间发生电荷转移而引起的。由于激发态分子往往比基态分子具有更强的氧化还原能力，因此，荧光物质的激发态分子比其基态分子更容易与其它物质的分子发生电荷转移作用。如甲基蓝分子（以M表示）可被Fe2+离子熄灭。
M*+ Fe2+→M-+ Fe3+
所生成的M－离子进一步发生下列反应而成为无色染料
M-+H+→MH（半醌）
2MH→M+MH2（无色染料）
④转入三重态熄灭 由于内部能量转移，发生由激发单重态到三重态的系间窜跃，多余的振动能在碰撞中损失掉而使荧光熄灭。如二苯甲酮，其最低激发单重态是（n，π*）态，由于n→π*跃迁是部分禁阻的，因而π*→n跃迁也是部分禁阻的，处于（n，π*）态的最低激发单重态的寿命要比处于（π，π*）态的长，从而转化为三重态的几率也就比较大。此外，（n，π*）态的S1和T1之间的能量间隙通常比较小，有利于加速S1→T1系间窜跃过程的速度。
⑤光化学反应熄灭 由光致激发态分子所发生的化学反应称为光化学反应，它可以是单分子也可以是双分子反应。荧光分析中因发生光化学反应导致熄灭现象经常遇到，其中，影响较大的是光解反应和光氧化还原反应。某些光敏物质在紫外或可见光照射下很容易发生预离解跃迁，（分子在接受能量跃迁过程中，使某些键能低于电子激发能的化学键发生断裂的这种跃迁）表现在荧光测定过程中荧光强度随光照时间而减弱。
⑥自熄灭和自吸收 当荧光物质浓度较大时，常会发生自熄灭现象，使荧光强度降低。这可能是由于激发态分子之间的碰撞引起能量损失。当荧光物质的荧光光谱曲线与吸收光谱曲线重叠时，荧光被溶液中处于基态的分子吸收，称为自吸收。
4. 荧光强度和溶液浓度的关系
荧光强度If 正比于吸收激发光强Ia与荧光效率Φf
If =Φf Ia
（5.2）
又根据比尔定律，得
Ia =I0-It=I0（1-10-εbc）
（5.3）
式中，I0和It分别为入射光强和透射光强。
将式（5.3）代入式（5.2）得
If =Φf
I0（1-10-εbc）
（5.4）
展开上式，并在εbc≤0.05的条件下得
If =2.3ΦfI0εbc
（5.5）
当入射光强度I0和b一定时，Φf和ε也是常数，得
If=Kc
（5.6）
由此可见，在低浓度时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系且增大入射光的强度，可以增大荧光的强度。在高浓度时，由于荧光熄灭和自吸收等原因，使荧光强度与溶液的浓度不呈线性关系。
荧光和磷光分析仪器与大多数光谱分析仪器一样，主要由光源、单色器（滤光片或光栅）、试样池、检测器和放大显示系统组成。不同的是荧光和磷光仪器需要两个独立的波长选择系统，一个用于激发，一个用于发射。
荧光分析使用的仪器可分为荧光计和荧光分光光度计二种类型。它们通常均由光源、单色器（滤光片或光栅）、液槽及检测器组成。
图5.4为荧光分光光度计示意图。由光源发出的光，经第一单色器（激发单色器）后，得到所需要的激发光波长。设其强度为I0，通过试样池后，由于一部分光被荧光物质所吸收，故其透射强度减为I。荧光物质被激发后，将向四面八方发射荧光，但为了消除入射光及散射光的影响，荧光的测量应在与激发光呈直角的方向上进行。仪器中的第二单色器称为荧光单色器，它的作用是消除溶液中可能共存的其他光线的干扰，以获得所需要的荧光。
由光源发出的激发光，经过第一单色器（激发光单色器），选择最佳波长的光去激发样品池内的荧光物质。荧光物质被激发后，将向四面八方发射荧光。但为了消除激发光及散射光的影响，荧光的测量不能直接对着激发光源，所以，荧光检测器通常是放在与激发光呈直角的方向上。否则，强烈的激发余光会透过液池干扰荧光的测定，甚至会损坏检测器。第二单色器（荧光单色器）的作用是消除荧光液池的反射光、瑞利散射光，拉曼散射光（见第四节）以及其它物质所产生的荧光的干扰，以便使待测物质的特征性荧光照射到检测器上进行光电信号转换，所得到的电信号，经放大后由记录仪记录下来。
1.光源
光源应具有强度大，适应波长范围宽两个特点。常用光源有高压汞灯和氙弧灯。
高压汞灯的平均寿命约为1500～3000
h，荧光分析中常用的是365、405、436 nm三条谱线。
氙弧灯（氙灯）是连续光源，发射光束强度大，可用于200～700
nm波长范围。在300～400
nm波段内，光谱强度几乎相等。
此外，高功率连续可调染料激光光源是一种新型荧光激发光源。激发光源的单色性好，强度大。脉冲激光的光照时间短，并可避免感光物质的分解。
2. 单色器
简易的荧光计一般采用滤光片作单色器，由第一滤光片分离出所需要的激发光，用第二滤光片滤去杂散光和杂质所发射的荧光。但这种仪器只能用于荧光强度的定量测定，不能给出荧光的激发与发射光谱。荧光分光光度计最常用的单色器是光栅单色器，它具有较高的分辨率，能扫描光谱；缺点是杂散光较大，有不同的次级谱线干扰，但可用合适的前置滤光片加以消除。
3. 样品池
样品池通常是石英材料的方形池，四个面都透光。放入池架中时，要用手拿着棱并规定一个插放方向，免得各透光面被指痕污染或被固定簧片擦坏。
4. 狭缝
狭缝越小单色性越好，但光强度和灵敏度下降。当入射狭缝和出射狭缝的宽度相等时，单色器射出的单色光有75% 的能量是辐射在有效的带宽内。此时，既有好的分辨率，又保证了光通量。
5. 检测器
简易的荧光计可采用目视或硒光电池检测。但一般较精密的荧光分光光度计均采用光电倍增管检测。施加于光电倍增管的电压越高，放大倍数越大，电压每波动1V，增益就随之波动 3%，所以，要获得良好的线性响应，要有稳定的高压电源。光电倍增管的响应时间很短，能检测出10-8和10-9 s的脉冲光。
另外，荧光分光光度计使用的检测器还有光导摄象管。它具有检测效率高、动态范围宽、线性响应好、坚固耐用和寿命长等优点，但其检测灵敏度不如光电倍增管。
6. 读出装置
荧光仪器的读出装置有数字电压表、记录仪和阴极示波器等几种。数字电压表用于例行定量分析，既准确、方便又便宜。记录仪多用于扫描激发光谱和发射光谱。阴极示波器显示的速度比记录仪快得多，但其价格比记录仪高得多。
在荧光光度计上配上磷光附件，即可用于磷光测定。磷光附件包括：
（1）液槽为了实现在低温下测量磷光，需将样品溶液放置在盛液氮的石英杜瓦瓶内。
（2）磷光镜有些物质能同时产生荧光和磷光，为了能在荧光发射的情况下测定磷光，通常必须在激发单色器与液槽之间以及在液槽和发射单色器之间各装一个斩波片（磷光镜），并由一个同步电动机带动，如图5.5所示。现以转盘式磷光镜为例说明其工作原理。当两个斩波片（磷光镜）调节为同相时，荧光和磷光一起进入发射单色器，测到的是荧光和磷光的总强度；当两个斩波片（磷光镜）调节为异相时，激发光被挡住，此时，由于荧光寿命短，立即消失，而磷光的寿命长，所以测到的仅是磷光信号。利用斩波片（磷光镜），不仅可以分别测出荧光和磷光，而且可以通过调节两个斩波片（磷光镜）的转速，测出不同寿命的荧光。这种具有时间分辨功能的装置，是磷光光度计的一个特点。
由于磷光是由激发三重态经禁阻跃迁返回基态，很容易受其他辐射或无辐射跃迁的干扰而使磷光减弱，甚至完全消失。为了获得较强的磷光，宜采取下列一些措施：
图5.5 磷光镜
（a）转筒式磷光镜；（b）转盘式磷光镜。
①低温磷光在低温如液氮（77 K）甚至在液氦（4 K）的冷冻下，使样品冷冻为刚性玻璃体。这时振动耦合和碰撞等无辐射去活化作用降到最低限度，磷光增强。
②固体磷光在室温条件下，测量吸附在固体基质上（如滤纸，硅胶等）的待测物质所发射的磷光，称为固体磷光法。这样可以减少激发三重态的碰撞熄灭等无辐射跃迁的去活化作用，获得较强的磷光。
③分子缔合物的形成在试液中，表面活性剂与待测物质形成胶束缔合物后，可增加其刚性，减少了激发三重态的内转化及碰撞熄灭等无辐射跃迁去活化作用，增加了激发三重态的稳定性，获得较强的磷光。
④重原子效应如前所述，在含有重原子的溶剂中，将使待测物质的荧光减弱，磷光得到加强。
由于能产生荧光和磷光的化合物占被分析物的数量有限，并且许多化合物发射的波长相差较小，故荧光和磷光法很少用于定性分析。
光致发光可以定量分析如下三类物质：试样本身发光；试样本身不发光（其中一类试样本身不发光，但与一个荧光或磷光的试剂反应而转化为发光物；另一类试样本身既不发光又不能转化为发光物质，但能与一个发光物质反应生成一不发光的产物）。
荧光分析的定量分析一般多采用比较法和工作曲线法。值得注意的是，在定量测定上述三类物质时，它们的具体操作不尽相同。
在分光光度法中，由于被检测的信号为A=lgI0/I，即当试样浓度很低时，检测器所检测的是两个较大的信号（I0及I）的微小差别，这是难以达到准确测量的。然而在荧光光度法中，被检测的是叠加在很小背景值上的荧光强度，从理论上讲，它是容易进行高灵敏、高准确测量的，与分光光度法相比较，荧光法的灵敏度要高2～4个数量级，常用于分析10-5～10-8 molL-1范围的物质。
1.比较法
如果试样数量不多，可用比较法进行测定。取已知量的纯荧光物质配制和试液浓度
相近的标准溶液cs，并在相同的条件下测得它们的荧光强度
和FS，若有试剂空白F0须扣除，然后按下式计算试液的浓度：
（5.7）
2.工作曲线法
将已知量的标准物质经过与试样的相同处理后，配成一系列标准溶液并测定它们的相对荧光强度，以相对荧光强度对标准溶液的浓度绘制工作曲线，由试液的相对荧光强度对照工作曲线求出试样中荧光物质的含量。工作曲线法适用于大批样品的测定。
3.荧光猝灭法
荧光猝灭剂的浓度cQ与荧光强度的关系可用Stern—Volmer方程表示：
F0/F=1+KcQ （5.8）
F0与F分别为猝灭剂加入前与加入后试液的荧光强度。由式（5.8）可见，F0/F与猝灭剂浓度之间有线性关系，与工作曲线法相似，对一定浓度的荧光物质体系，分别加入一系列不同量的猝灭剂Q，配成一个荧光物质一猝灭剂系列，然后在相同条件下测定它们的荧光强度。以F0与F值对cQ绘制工作曲线即可方便地进行测定。该法具有较高的灵敏度和选择性。
4.多组分混合物的荧光分析
如果混合物中各组分的荧光峰相互不干扰，可分别在不同波长处测定，直接求出它们的浓度。如果荧光峰互相干扰，但激发光谱有显著差别，其中一个组分在某一激发光下不会产生荧光，因而可选择不同的激发光进行测定。例如Al3+和Ga3+离子的8-羟基喹啉配合物的氯仿萃取液，荧光峰均在520 nm，但激发峰分别为365 nm和435.8 nm，因此，可分别用365 nm及435.8 nm激发，在520 nm测定。
如果在同一激发光波长下荧光光谱互相严重干扰，可以利用荧光强度的加合性，在适宜的荧光波长处测定，用列联立方程式的方法求结果。
1.绝对灵敏度Sα
绝对灵敏度是用荧光物质的荧光量子产率
和摩尔吸收系数K的乘积表示的灵敏度。
（5.9）
Sα值越大，表示荧光物质越易发射荧光，灵敏度越高。
2.以硫酸奎宁的检出限表示仪器的灵敏度
由于实际测定时，激发光源的强度和光电倍增管的光谱特性随波长而改变，灵敏度受仪器的质量（如光源的强度及其稳定性、单色器杂散光水平，光电倍增管的特性及放大器的质量等）和工作条件等诸多因素的影响，因此，同一物质在不同的条件和仪器上测定的灵敏度不同。所以常以在特定条件下能检出硫酸奎宁（0.05 mol·L-1 H2SO4水溶液）的最低浓度（即检出限）为指示来表示荧光仪器的灵敏度，其值多在10-10～10
3.用纯水拉曼峰信噪比（S/N）表示仪器的灵敏度
当激发光照射荧光体溶液时，其能量一般不足以使溶剂或其它杂质分子中的电子跃迁到电子激发态，但可能将电子激发到基态中其它较高的振动能级。倘若电子受激后能量没有损失并且在瞬间（约10-12 S）内又返回到原来的振动能级，便会在各个不同的方向发射和激发光相同波长的辐射，这种辐射称为瑞利散射光。其强度与光波长的四次方成反比。溶剂和其它杂质的瑞利散射光会干扰荧光的测定，一般由第二单色器滤去散射光以消除其影响，所以，单色器的分辨器越高，荧光的斯托克斯位移越大，散射光的影响越小。
除瑞利散射光外，被激发到基态中其它较高振动能级的电子，也可能返回到比原来的能级稍高或稍低的振动能级，便会产生波长略长或略短于激发光波长的散射光，称为拉曼光。拉曼光的波长随激发光的波长改变而改变，但与激发光之间存在一定的频率差值。一般情况下，拉曼光的强度比瑞利散射光和荧光体的荧光要弱得多。
近来仪器的灵敏度趋向于用纯水的拉曼峰的信噪比（S/N）表示，以纯水的拉曼峰高为信号值（S），并固定发射波长，使记录仪器进行时间扫描，以求出仪器的噪声大小（N），用S/N值作为衡量仪器灵敏度的指标，其值大多在20～200之间。水的拉曼峰越高，仪器的噪声越小，S/N值就越大，仪器对荧光信号的检测就越灵敏。因此，这种方法不但简单易行，而且比较符合实际情况，被人们广泛采用。
荧光分析法具有灵敏度高，选择性好，工作曲线线性范围宽等优点，且能提供分子的激发光谱、荧光光谱、荧光寿命、荧光效率及荧光强度等诸多信息。因此，它不但已成为一种重要的痕量分析技术，还能从不同角度为研究分子结构提供信息，使其在生物化学和药物学方面的研究发挥重大作用。
1.无机化合物的分析
无机化合物能直接产生荧光并用于测定的很少，但与有机试剂形成络合物后进行荧光测定的元素目前已达到60多种。其中铝、铍、镓、硒、钙、镁及某些稀土元素常用荧光法测定。
(1)直接荧光法 利用金属离子或非金属离子与有机络合剂生成能发荧光的络合物，通过测量络合物的荧光强度进行定量分析。
(2)荧光熄灭法 有些无机离子不能形成荧光络合物，但它可以从金属离子与有机试剂生成的荧光络合物中夺取金属离子或与有机试剂形成更稳定的络合物，使荧光络合物的荧光强度降低，测量荧光强度减弱的程度可以确定该无机离子的含量。荧光熄灭法广泛地应用于测定阴离子。某些无机物质的荧光测定法见表5.2。
表5.2 某些无机物的荧光测定法
|
离子 |
试剂 |
吸收波长/nm |
荧光波长/nm |
检出限/ μg·mL-1 |
干扰 |
|
Al3+ F- B4O72- Cd2+ Li+ Sn4+ Zn2+ |
石榴茜素R 石榴茜素R-Al络合物（猝灭） 二苯乙醇酮 2-（邻-羟基苯）-间氮杂氧 8-羟基喹啉 黄酮醇 二苯乙醇酮 |
470 470 370 365 370 400 － |
500 500 450 蓝色 580 470 绿色 |
0.007 0.001 0.04 2 0.2 0.008 10 |
Be、Co、Cr、Cu、F-、NO3-、Ni、PO43-、Th、Zr Be、Co、Cr、Cu、Fe、Ni、PO43-、Th、Zr Be、Sb NH3 Mg F-、PO43-、Zr Be、B、Sb、显色离子 |
2.有机化合物的分析
(1)脂肪族有机化合物的分析 在脂肪族有机化合物中，本身会产生荧光的并不多，如醇、醛、酮、有机酸及糖类等。但可以利用它们与某种有机试剂作用后生成会产生荧光的化合物，通过测量荧光化合物的荧光强度来近行定量分析。例如，甘油三酸酯是生理化验的一个项目。人体血浆中甘油三酸酯含量的增高被认为是心脏动脉疾病的—个标志。测定时，首先将其水解为甘油，再氧化为甲醛，甲醛与乙酰丙酮及氨反应生成会发荧光的3，5-二乙酰基-1，4-二氢卢剔啶，其激发峰在405 nm，发射峰在505 nm，测定浓度范围为400～
具有高度共轭体系的脂肪族化合物，如维生索A、胡萝卜素等本身能产生荧光，可直接测定；例如，血液中维生素A，可用环己烷萃取后，以345 nm为激发光，测量490 nm波长处的荧光强度，可以测定其含量。
(2)芳香族有机化合物的分折 芳香族化合物具有共轭的不饱和体系，多能产生荧光，可直接测定。例如，3，4-苯并芘是强致癌芳烃之一。它在H2SO4介质中用520 nm激发光测定545 nm波长处的荧光强度，可测定其在大气及水中的含量。
此外，药物中的胺类、甾体类、抗生素、维生素、氨基酸、蛋白质、酶等大多具有荧光，可用荧光法测定。
在研究生物活性物质与核酸的作用及蛋白质的结构和机能方面，荧光分析法是重要的手段之一。某些有机化合物的荧光测定法见表5.3。
表5.3 某些有机化合物的荧光测定法
|
测定物质 |
试剂 |
激发光波长/nm |
荧光波长/nm |
测定范围c/(μg·mL-1) |
|
丙三醇 糠醛 蒽 苯基水杨酸酯 1-萘酚 阿脲（四氧嘧啶） 维生素A 氨基酸 蛋白质 肾上腺素 胍基丁胺 玻璃酸酶 青霉素 |
苯胺 蒽酮 N, N-二甲基甲酰胺(KOH) 0.1 mol·L-1 NaOH 苯二胺 无水乙醇 氧化酶等 曙红Y 乙二胺 邻苯二醛 3-乙酰氧基吲哚 α-甲氧基-6-氯-9-（β-氨乙基）-氨基氮杂蒽 |
紫外 465 365 366 紫外 (365) 345 315 紫外 420 365 395 420 |
蓝色 505 400 410 500 485 490 425 540 525 470 470 500 |
0.1～2 1.5～15 0～5 3×10-8～5×10-6
mol·L-1 10-10 0～20 0.01～50 0.06～6 0.001～0.02 0.05～5 0.001～0.033 0.0625～0.625 |
随着激光、计算机和电子学的新成就等一些新的科学技术的引入，促进了诸如同步荧光、导数荧光、时间分辨荧光、相分辨荧光、荧光偏振、荧光免疫、低温荧光、固体表面荧光等诸多新方法以及荧光反应速率法、三维荧光光谱技术和荧光光纤传感器等的发展，加速了各式各样新型的荧光分析仪器的问世，使荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观和自动化的方向发展，其灵敏度、准确度和选择性日益提高。如今，荧光分析法已经发展成为一种重要而有效的光谱分析技术。
由于能产生磷光的物质数量很少，外加上测量时需在液氮温度下进行，因此在应用上磷光分析远不及荧光分析普遍。但是通常具有弱荧光的物质能发射较强磷光，例如含有重原子（氯或硫）的稠环芳烃常常能发射较强的磷光，而不存在重原子的这些化合物则发射的荧光强于磷光，故在分析对象上，磷光与荧光法互相补充，成为痕量有机分析的重要手段。磷光分析已用于测定稠环芳烃和石油产物（表5.4）；农药、生物碱和植物生长激素的分析；药物分析和临床分析等。另外，磷光分析技术已应用于细胞生物学和生物化学的研究领域。例如用磷光分析法检验某些生物活性物质，通过其磷光特性以研究蛋白质的构象，利用磷光以表征细胞核的组分等。
表5.4 某些稠环芳烃室温磷光分析
|
化合物 |
λex/nm |
λem/nm |
重原子 |
检出限/ng |
|
吖啶 苯并（α）芘 苯并（e）芘 2,3-苯并芴 咔唑 1,2,3,4-二苯并蒽 1,2,5,6-二苯并蒽 13H-二苯并(a、i)咔唑 萤蒽 芴 1-萘酚 芘 |
360 395 335 343 296 295 305 295 365 270 310 343 |
640 698 545 505 415 567 555 475 545 428 530 595 |
Pb(OAc)2 Pb(OAc)2 CsI NaI CsI CsI NaI NaI Pb(OAc)2 CsI NaI Pb(OAc)2 |
0.4 0.5 0.01 0.028 0.005 0.08 0.005 0.002 0.05 0.2 0.03 0.1 |
5.2 化学发光分析法
化学发光（Chemiluminescence）又称为冷光（Cold Light），它是在没有任何光、热或电场等激发的情况下，由化学反应而产生的光辐射。生命系统中也有化学发光，称生物发光（Bioluminescence），如萤火虫、某些细菌或真菌、原生动物、蠕虫以及甲壳动物等所发射的光。化学发光分析（Chemiluminescence
Analysis）就是利用化学反应所产生的发光现象进行分析的方法。它是近30多年来发展起来的一种新型、高灵敏度的痕量分析方法。在痕量分析、环境科学、生命科学及临床医学上得到愈来愈广泛的应用。
化学发光具有以下几个特点：
（1）极高的灵敏度，荧光虫素（LH2）（luciferin）、荧光素酶（luciferase）和磷酸三腺苷（ATP）的化学反应可测定2×10-17 mol/L的ATP，可检测出一个细菌中的的ATP含量。
（2）由于可以利用的化学发光反应较少，而且化学发光的光谱是由受激分子或原子决定的，一般来说也是由化学反应决定的。很少有不同的化学反应产生出同一种发光物质的情况，因此化学发光分析具有较好的选择性。
（3）仪器装置比较简单，不需要复杂的分光和光强度测量装置，一般只需要干涉滤光片和光电倍增管即可进行光强度的测量。
（4）分析速度快，一次分析在1 min之内就可完成，适宜自动连续测定。
（5）定量线性范围宽，化学发光反应的发光强度和反应物的浓度在几个数量级的范围内成良好的线性关系。
化学发光是基于化学反应所提供足够的能量，使其中一种产物的分子的电子被激发成激发态分子，当其返回基态时发射一定波长的光，称为化学发光，表示如下
A + B → C* + D
C*→ C +hυ
化学发光包括吸收化学能和发光两个过程。为此，它应具备下述条件：
（1）化学发光反应必须能提供足够的化学能，以引起电子激发。
（2）要有有利的化学反应历程，以使所产生的化学能用于不断地产生激发态分子。
（3）激发态分子能以辐射跃迁的方式返回基态，而不是以热的形式消耗能量。
化学发光反应的化学发光效率Φcl，取决于生成激发态产物分子的化学激发效率Φr利激发态分子的发光效率Φf这两个因素。可用下式表示：
化学发光的发光强度ICl以单位时间内发射的光子数来表示，它等于化学发光效率ΦCl与单位时间内起反应的被测物浓度CA的变化（以微分表示）的乘积，即：
（5.10）
通常，在发光分析中，被分析物的浓度与发光试剂相比，要小很多，故发光试剂浓度
可认为是一常数，因此发光反应可视为是—级动力学反应，此时反应速率可表示为：
式中k为反应速率常数。由此可得：在合适的条件下，t时刻的化学发光强度与该时刻的分析物浓度成正比，可以用于定量分析，也可以利用总发光强度S与被分析浓度的关系进行定量分析，此时，将式（5.7）积分，得到
（5.11）
如果取t1＝0，t2为反应结束时的时间，则得到整个反应产生的总发光强度与分析物的浓度呈线性关系。
1.气相化学发光
主要有O3，NO和SO2，S，CO的化学发光反应，应用于检测空气中的O3，NO，NO2，H2S，SO2和CO2等。
火焰化学发光也属于气相化学发光范畴。在300～400 ℃的火焰中，热辐射是很小的，某些物质可以从火焰的化学反应中吸收化学能而被激发，从而产生火焰化学发光。火焰化学发光现象多用于硫、磷、氮和卤素的测定。
2.液相化学发光
用于分析上的液相化学发光体系很多,常用于化学发光分析的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉碱、没食子酸、过氧草酸盐等，但研究和应用比较广泛的有鲁米诺(Luminol) 和光泽精（lucigenin）。
(1) 鲁米诺体系 鲁米诺（3-氨基苯二甲酰环肼）也称为冷光剂，在碱性水溶液、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺等极性有机溶剂中能被某些氧化剂（如H2O2，ClO-，I2，K3Fe(CN)6，MnO4-，Cu2+等）氧化，产生最大辐射波长为425 nm（水溶液）或485 nm（二甲基亚砜溶液）的光，化学发光效率为0.01～0.05。其发光历程如下：
氨基邻苯二甲酸根
据此建立了这些氧化剂的化学发光分析法。
鲁米诺被H2O2氧化的反应速度很慢，但许多金属离子在适当的反应条件下能增大这一发光反应的速度，在一定的浓度范围内，发光强度与金属离子浓度呈良好的线性关系，故可用于痕量金属离子的测定。这些方法的灵敏度都非常高，可测定50余种元素和大量有机、无机化合物。但由于至少有约30种金属离子会催化或抑制该反应，使方法的选择性不好，限制了在实际工作中的应用。
（2）光泽精体系 光泽精（N，N-二甲基-9，9′-联吖啶二硝酸盐）在碱性溶液中与H2O2反应生成激发态的N－甲基吖啶酮，产生最大发射波长为470 nm的化学发光，其Φcl为1%～2%。该体系可测定Fe2+、Fe3+、Cr3+、Mn2+、Ag+等，尤其是可以测定Luminol体系不能直接测定的Pb2+、Bi3+等离子。还可以测定丙酮、羟胺、果糖、Vc、谷胱甘肽、尿素、肌酸酐和多种酶。用光泽精作化学发光探针，可用来测定人体全血中吞噬细胞的活性。该体系可测定甲醛、甲酸、H2O2、葡萄糖、氨基酸、多环芳胺类化合物和Zn2+、Cr6+、Mo6+、V5+等多种金属离子。
气相化学发光反应主要用于某些气体的检测，目前已有各种专用的监测仪。下面主要介绍液相化学发光反应的检测。
在液相化学发光分析中，当试样与有关试剂混合后，化学发光反应立即发生，且发光信号瞬间即消失。因此，如果不在混合过程中立即测定，就会造成光信号的损失。由于化学发光反应的这一特点，样品与试剂混合方式的重复性就成为影响分析结果精密度的主要因素。目前，按照进样方式，可将发光分析仪分为分离取样式和流动注射式两类。
1.分离取样式
分离式化学发光仪是一种在静态下测量化学发光信号的装置。它利用移液管或注射器将试剂与样品加入反应室中，靠搅动或注射时的冲击作用使其混合均匀，然后根据发光峰面积的积分值或峰高进行定量测定。
分离取样式仪器具有设备简单、造价低、体积小和灵敏等优点，还可记录化学发光反应的全过程，故特别适用于反应动力学研究。但这类仪器存在两个严重缺点：一是手工加样速度较慢，不利于分析过程的自动化，且每次测试完毕后，要排除池中废液并仔细清洗反应池，否则产生记忆效应；另一点是加样的重复性不好控制，从而影响测试结果的精密度。
2.流动注射式
流动注射式是流动注射分析在化学发光分析中的一个应用。光度法、化学发光法、原子吸收光度法和电化学法的许多间隙操作式的方法，都可以在流动注射分析中得到快速、准确而自动地进行。流动注射分析是基于把一定体积的液体试样注射到一个运动着的、无空气间隔的、由适当液体组成的连续载流中，被注入的试样形成一个带，然后被载流带到检测器中，再连续地记录其光强、吸光度、电极电位等物理参数。在化学发光分析中，被检测的光信号只是整个发光动力学曲线的一部分，以峰高来进行定量分析。
在发光分析中，要根据不同的反应速度，选择试样准确进到检测器的时间，以使发光峰值的出现时间与混合组分进入检测器的时间恰好吻合。目前，用流动注射式进行化学发光分析，得到了比分离式发光分析法更高的灵敏度与更好的精密度。
化学发光分析法最显著的特点是灵敏度高，又能进行快速连续的分析，已广泛地应用于痕量元素的分析、环境监测、生物学及医学分析的各个领域。
1.气相化学发光法的应用
气相化学发光已广泛用于大气污染检测，测定对象主要有两类，一类是常温下呈气态的氰化物、硫化物、氮化物、臭氧和乙烯等，另一类是在火焰中易生成气态原子的P、N、S、Te和Se等元素。
2.液相化学发光法的应用
表5.5给出了鲁米诺及其衍生物的发光反应及其部分应用。
鲁米诺及其衍生物的发光反应除了测定痕量金属离子以外，还可以应用于有机物、药物、生物体液中的低含量激素、新陈代谢物的测定（表5.5）。
表5.5 鲁米诺化学发光体系的部分应用
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分析物 |
氧化剂-添加剂 |
检出限/ mol·L-1 |
灵敏度/ μg·mL-1 |
|
Co(Ⅱ) Cu(Ⅱ) Ni(Ⅱ) Cr(Ⅲ) Fe(Ⅱ) Fe(Ⅲ) Mn(Ⅱ) V(Ⅳ) V(Ⅴ) Ir(Ⅳ) Ce(Ⅳ) Th(Ⅳ) Ti(Ⅳ) Hf(Ⅳ) 过氧化物 葡萄糖 尿酸 胆固醇 |
H2O2 H2O2 H2O2 H2O2 O2 H2O2-amine H2O2-amine O2-P2O74- H2O2-Co 配合物 KIO4 H2O2-Cu2+ H2O2-Cu2+ H2O2-Cu2+ H2O2-Cu2+ 葡萄糖氧化酶 尿酸酶 胆固醇氧化酶 |
10-10 10-9 10-8 10-9～10-10 10-10 10-8 10-8～10-7 10-8～10-7 10-8～10-7 10-8～10-7 |
0.0002 0.002 0.04 0.04 0.1﹡ 1.0﹡ 0.02﹡ 0.01﹡ |
﹡采用化学发光抑制法
例如机体中的超氧阴离子·O2-，能直接与鲁米诺作用产生化学发光而被检测，灵敏度高，仪器设备简单，便于推广。机体中的超氧化物歧化酶（SOD）能促使·O2-歧化为O2和H2O2，故SOD对·O2-有清除作用，由于SOD的存在，使鲁米诺-·O2-体系的化学发光受到抑制，可间接测定SOD。
思考题与习题
5.1试从原理和仪器两个方面比较分子荧光、磷光和化学发光的特点。
5.2何为荧光（磷光）的激发光谱和发射光谱？如何绘制？它们有何特点？
5.3简述荧光和磷光发射的过程。有机化合物的荧光与其结构有何关系？
5.4解释下列术语：
（1）荧光量子产率；（2）荧光猝灭；（3）系间跨越；（4）振动弛豫；（5）重原子效应。
5.5写出荧光强度的数学表达式，说明式中各物理量的意义。影响荧光强度的因素是什么？
5.6试解释荧光分析法比紫外－可见分光光度法灵敏度高的原因。
5.7下列各组化合物或不同条件中，预测哪一种荧光产率高？为什么？
(1)
偶氮苯
二氮杂菲
(2)
pH=3及pH＝10时的苯胺。
(3)
(4)
5.8提高磷光测定灵敏度的方法有哪些？
5.9
NADH的还原型是一种重要的强荧光性物质，其最大激发波长为340 nm，最大发射波长为465 nm，在一定的条件下测得NADH标准溶液的相对荧光强度如下表所示。根据所测数据绘制标准曲线，并求出相对荧光强度为42.3的未知液中NADH的浓度。
|
NADH(×10-8mol·L-1) |
相对荧光强度If |
NADH(×10-8mol·L-1) |
相对荧光强度If |
|
1.00 |
13.0 |
5.00 |
59.7 |
|
2.00 |
24.6 |
6.00 |
71.2 |
|
3.00 |
37.9 |
7.00 |
83.5 |
|
4.00 |
49.0 |
8.00 |
95.0 |